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6mA/m6A:同宗同根,黑马诞生

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6mA/m6A:同宗同根,黑马诞生

发布日期:2019-11-15 作者:威尼斯官网 点击:

表观遗传学自提出以来,众多关于表观相关的技术日新月异的发展,这些技术也为表观遗传学的发展助力。在众多表观研究中,甲基化无疑是其中最重要的一环,尤其是DNA甲基化

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▲胚胎发育中DNA甲基化情况

在生命生长发育过程中,会涉及到多种甲基化,DNA甲基化RNA甲基化和蛋白质甲基化。而DNA甲基化前期研究最多的就是5-甲基胞嘧啶(5mC)的修饰类型。

近年来,RNA甲基化也受到众多科学家的青睐,相关研究报道的文章如雨后春笋般发表。尤其是2018年和2019年的国自然公布结果看,RNA的N-甲基腺嘌呤(m6A)修饰一篇蓝海。关于RNA甲基化修饰中涉及到的调控因子也越来越受到关注。热门关注点要么关注Writers(METTL3、METTL14和WTAP等),要么关注Erasers(ALKBH5和FTO),要么就是Readers(YTHDC1、YTHDF1和YTHDF3等)或者干脆放弃研究这些调控因子功能,转而研究与组蛋白甲基化修饰的关联。

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▲m6A的调控机制

但是与m6A同宗的DNA另一种甲基化修饰N-甲基腺嘌呤(6mA)修饰却并未如m6A一样势如破竹。或者说在真核生物中研究步伐稍显迟缓。较研究历史来说,DNA的N6-腺嘌呤甲基化修饰(6mA)比RNA的N6-腺嘌呤甲基化修饰(m6A)更早受到关注,但也仅限于原核生物。究其原因,也许是因为在生物体中的丰度不同造成相关结果。在哺乳动物中,RNA的N6-腺嘌呤甲基化修饰(m6A)的比例为0.1-0.4%,平均每条m6A有3-5个m6A位点;而对于DNA,其表达丰度非常低,在哺乳动物中,平均每百万个腺嘌呤中只有不到10个6mA位点。低频率、低含量的限制造成检测的困难。但是随着检测技术的发展,高灵敏度质谱分析方法成为可能,而高通量测序技术的发展以及低起始量建库测序技术的革新,6mA的全基因组范围内研究已经不再受到限制。

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▲6mA调控机制

在真核生物基因组中,有四种不同的6mA分布模式:在绿色藻类中转录起始位点(TSS)附近富集;在秀丽线虫中广泛分布;在青蛙和老鼠中TSS附近耗尽;在果蝇、斑马鱼和老鼠中重复元素富集。

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而植物中关于m6A的全基因组分布及调控情况研究较少,目前已知的只有拟南芥和水稻的m6A分布情况稍有报道。

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▲水稻、拟南芥和衣藻全基因组中不同检测方法检测的6mA/A水平

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▲水稻全基因组范围内6mA分布情况

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▲拟南芥全基因组范围内6mA分布情况

当然,关于DNA的N6-腺嘌呤甲基化修饰(6mA)肯定有很多科学家正在研究或者即将要研究,随着其在基因组的分布情况及调控因子的发现,关于真核生物中DNA的N6-腺嘌呤甲基化修饰(6mA)的调控机制将会进一步揭示。据目前研究推测6mA在真核生物中作为DNA的5-甲基胞嘧啶甲基化修饰(5mC)的一种补充,其在真核生物的功能将会被进一步为人类所了解,届时,DNA甲基化研究也将会大迈步向前跨进。

关于DNA的N6-腺嘌呤甲基化修饰(6mA)和RNA的N6-腺嘌呤甲基化修饰(m6A)研究方法大致相同,主要分三步:

第一步:材料的制备

材料的制备可以是通过基因敲除(敲低)或者是不同生长组织(不同细胞、不同组织部位)或者不同生长条件等;

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 ▲不同材料的选取

第二步:6mA或m6A含量的测定

6mA或m6A含量的测定方法有LC-MS/MS 或Dot blot,其检测流程见下图。

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▲LC-MS/MS和Dot Blot流程图

LC-MS/MS 或Dot blot检测方法的不同点在于LC-MS/MS可以准确定量6mA/A(m6A/A),而Dot Blot只能大致评估6mA(m6A)水平。

第三步:高通量测序技术

在高通量测序技术中,常规主要是6mA-IP-seq(m6A-IP-seq)和SMRT(Single-molecule real-time sequencing)。

m6A-IP-seq (Methylated RNA immunoprecipitation sequencing)和6mA-IP-seq(DNA N6-methyladenine Immunoprecipitation Sequencing)都是利用特异性抗体富集6mA(m6A)片段,扩增后进行高通量测序及甲基化分析,以较小的数据量,快速地绘制全基因组DNA(RNA)甲基化水平的图谱。而SMRT(Single-molecule real-time sequencing)也叫作单分子实时测序技术,采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法,聚合酶合成每一个碱基,都有一个时间段,而当模板碱基带有修饰时,聚合酶会慢下来,使带有修饰的碱基两个相邻的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的比值结果大于1,由此就可以推断这个位置有修饰。

两种不同的方法各有优缺点,6mA-IP-seq(m6A-IP-seq)检测灵敏度高,能捕获到全基因组的甲基化修饰位点,但是它是非单碱基分布。而SMRT(Single-molecule real-time sequencing)能做到单碱基分布,属于三代测序范畴,但是其准备性因为读长较长原因而有所下降。总体来说,两种方法都可以检测全基因组范围内的N6-腺嘌呤甲基化修饰,要怎么抉择就看个人选择了。下图中展示了两种不同的测序方法的比较:

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▲SMRT及6mA-IP-seq(两张不同厂家抗体SYSY和Abcam)分析的6mA的peak重合情况

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▲SMRT测序及6mA-IP-seq(两张不同厂家抗体SYSY和Abcam)分析的6mA的保守motif情况


值得注意的是,6mA的定量需要严格的无菌样品制备,因为它有被原核DNA污染的可能性,而在原核DNA中,6mA是普遍存在的,且数量丰富。


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关键词:6mA,m6A,甲基化

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