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看siRNA如何借甲基化东风漂亮翻身

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看siRNA如何借甲基化东风漂亮翻身

发布日期:2019-09-19 作者: 点击:

DNA的甲基化是真核生物中保守的的表观修饰,也是研究最早的表观修饰。DNA甲基化主要发生在胞嘧啶上,根据其背景序列的差异,又可分为CGCHGCHH三种类型(H = ACT)。DNA甲基化的动态变化有多种甲基修饰酶等调控,在植物中,RNA指导的DNA甲基化(RdDM)途径被证明参与了三种类型DNA甲基化的从头建立,因此受到了广泛的关注。RdDM途径简单讲就是siRNA与一些功能蛋白共同发挥作用,在特定位点建立DNA甲基化,因此该过程主要包括了两个步骤,第一步siRNA的合成,其中Pol IVRNA聚合酶IV)和DCLDICER-LIKES)发挥了重要作用,第二步,siRNA介导DNA甲基化建立,PolVAGO4 / 6ARGONAUTE 4/6)和DRMDOMAINS REARRANGED METHYLASEs)参与其中。

随着研究的愈发深入,DNA甲基化已经被证明广泛存在于基因表达调控、免疫反应、印记、基因组稳定性等诸多生命活动中。那么如何研究某一个生命过程中的DNA甲基化的变化?201812月,Genome BiologyIF=14.028)上发表文章Downregulation of RdDM during strawberry fruit ripening,文章探究了在草莓成熟过程中的DNA甲基化变化以及RdDM如何参与其中的。


1、实验材料

草莓成熟三个阶段材料:Fa1(绿色阶段)、Fa2(半红阶段)、Fa3(全红阶段),每组2个生物学重复


2、实验结果展示

2.1 不同成熟阶段果实DNA甲基化模式

选取不同成熟阶段的草莓果实(图1a),对其进行全基因组甲基化测序,转化率>99.6%,未成熟果实甲基化水平为7.5% 该结果与叶片甲基化程度较为相似。CG, CHG, CHH甲基化分别为40%11%2%。对于基因和TE密度低、中、高区域的DNA甲基化水平进行了研究,结果表明基因密度越高,甲基化水平越低,而TE密度高的区域,甲基化水平较高(图1b)。对成熟阶段的两个极端:完全未成熟阶段Fa1、完全成熟阶段Fa2,作者重点分析了甲基化情况,总的来说,成熟果实甲基化程度低于未成熟果实(图1d),说明在成熟过程中伴随着DNA甲基化降低。blob.png

2.2 DMRs探究进一步证实成熟过程中DNA甲基化水平降低

鉴于Fa1Fa3两个阶段重复性较好,作者针对两个阶段(Fa3 vs Fa1)进行差异甲基化区域(DMRs)的探究。鉴定出了466个超甲基化DMRs以及2300个低甲基化DMRs。从不同DMRs数目也可以推测成熟过程中伴随着DNA的低甲基化。针对不同的类型,作者也进行了相应的探究。发现三种类型CGCHGCHH变化区域与总的甲基化趋势一致(图2a)。针对代表性DMRs区域,作者进行了可视化展示(图2 b),并对不同类型DMRs区域C碱基的甲基化进行了探究,成熟阶段DNA甲基化水平降低,与之前结果一致。

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2.3 DNA甲基化抑制剂验证DNA甲基化参与果实成熟

为了验证DNA甲基化的降低在果实成熟中的重要性,作者对未成熟果实外施DNA甲基化抑制剂5-azacytidine,从表型看,外施抑制剂的材料明显早熟(图3a),针对特定功能基因作者进行了甲基化敏感qPCR,结果显示,成熟重要基因的甲基化水平降低(图3b)。这些实验证明DNA低甲基化在果实成熟中发挥了重要作用。随后对DMRs分布进行了探究,低甲基化DMRs主要集中在基因的启动子区,这结果说明成熟诱导的DNA低甲基化可能调控了基因的表达。

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2.4 RdDM途径基因表达降低

根据之前研究,成熟过程中低甲基化是由于去甲基化酶的高表,因此作者探究了草莓去甲基化酶的表达情况,根据同源性分析(图4a)以及表达分析(图4b),发现在草莓中去甲基化酶表达随着成熟过程降低。这与之前的研究不一致。随后作者对RdDM途径中的关键基因的表达进行了统计,发现RdDM途径中的关键基因的表达呈现下降趋势,该趋势与DNA甲基化变化趋势一致。据此说明,DNA甲基化的降低与DNA甲基转移酶的降低具有一致性。

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2.5 成熟过程中siRNA降低导致了低甲基化DMRs

RdDM途径中24nt siRNA发挥了重要作用。作者对Fa1Fa3两个阶段的材料全siRNA水平进行了分析,结果表明21nt24ntsiRNA丰富最高(图5a)。对24ntsiRNA分布规律进行了探究,结果显示在基因的启动子区和3′调控区显著富集(图5 b)。对于成熟过程中的低甲基化DMRs与整个基因组上siRNA分布比较,siRNA明显与低甲基化DMRs区域重叠。结果说明,siRNA的降低导致了甲基化水平的降低。

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2.6 DNA甲基化的改变调控了基因的表达从而调控了果实成熟

作者对Fa3Fa1的材料进行转录组测序2316个差异表达基因被鉴定(图6a),将DNA甲基化与基因表达关联分析,结果显示高表基因启动子区域甲基化水平降低(图6 bc)通过对低甲基化的上调和下调基因进行了GO富集分析,分析结果表明,高表达的基因多为细胞分裂、ABA合成、香味挥发等与成熟相关的基因,而下调基因多为光合作用以及一些代谢物合成等在成熟过程中低表的基因(图6d)。总之,DNA甲基化调控了许多成熟过程中重要基因的表达。

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总结:

本次研究,作者通过对不同成熟阶段的材料,对其甲基化进行探究,并通过甲基化抑制剂验证DNA甲基化的改变对成熟过程的调控作用。随后对RdDM途径中关键基因以及siRNA的表达进行探究,阐述DNA甲基化的改变机制。最后通过与转录组测序联合分析,对成熟过程中的差异基因进行深度挖掘,并阐述了DNA甲基化通过调控成熟过程中关键基因从而完成了草莓果实成熟的调控。

本篇文章,除了为了草莓成熟调控机制进行了探究以外,也为我们探究不同的生物过程中DNA甲基化的作用提供了思路,通过对特定生物过程中的材料的甲基化进行探究,并对差异甲基化原因进行探究,同时结合生物过程中关键基因,对DNA甲基化调控特定生命过程提供新的机制。


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本文网址:/news/478.html

关键词:WGBS,BS-seq,siRNA

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