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那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第二弹:免疫共沉淀及后续验证的陷阱

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那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第二弹:免疫共沉淀及后续验证的陷阱

发布日期:2019-07-15 作者:威尼斯官网 点击:

之前我们分享了关于染色质免疫共沉淀测序实验中染色质的提取及片段化可能遇到的坑(那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第一弹:预处理的漩涡),不少小伙伴早已经迫不及待地问小编富集部分及后续实验环节中还有哪些坑要躲?那么,我们今天就来看一下免疫共沉淀及后续验证的陷阱?

Q1:商业化ChIP抗体那么多,我该如何选择呢?

A1: ChIP实验中需要选择ChIP级别抗体,不同的抗体品牌都有ChIP级别或ChIP-seq级别的抗体,到底我该选择哪支抗体会更好呢?这里给大家推荐一个很好的抗体查询网站CiteAb(http://www.citeab.com/),它不仅可以查询到该某个体的全部信息,并且还可以获得ChIP抗体的文献引用次数,通常文献引用较多的那个当然是首选的抗体。

Q2:组蛋白修饰的抗体是不是只要是ChIP级别的就可以了?

A2: 组蛋白通常在生物体内是相对保守的,但也不代表所有的物种都是可以适用的。因为抗体生产都是以哺乳动物为载体的,其中,一些亲缘关系较远的物种可能就不一定合适了。小编接触过一些此类样本,如一些家禽、家畜及木本植物在某几个组蛋白修饰抗体上的保守性上就差一些。如下图为一个家畜组织的H3K27AC的Western Blot结果(曝光600s)。


01.jpg


Q3: 研究的转录因子没有合适的抗体是不是就不能做ChIP实验了?

A3:当然不会了,除了已经验证了的ChIP级别抗体外,也有一些老师选择退而求其次,选择IP/IHC/ICC级别的抗体进行尝试也是一种办法。因为这些级别的抗体与ChIP抗体一样识别的是蛋白的Native结构,只是有些抗体暂时还没经过ChIP验证,说不定也能得到较好的结果。除此之外,还有一种方法就是构建融合标签体系,将标签蛋白(Flag、His、HA、MYC、GFP)与目的蛋白进行融合表达,利用标签抗体捕获,从而获得标签抗蛋白-目的蛋白及DNA的信息。或者有些老师自己纯化抗原或合成多肽选择自己制备抗体。这些方法都有可能获得较好的ChIP-seq结果,但同时有着各自的缺陷。非ChIP级别的抗体或者自制抗体,由于没有经过验证,要想得到较好的结果,所以,在抗体用量上通常要进行多次摸索尝试。标签抗体也有它自身风险性:首先,是受体的选择,没有选择突变体作为受体而是以野生型作为受体,这样内源性的蛋白可能会和标签融合蛋白竞争性结合DNA,导致富集位点变少;其次,对照的选择,对照材料选择野生型而不是转标签的空载,标签蛋白可能本身会有与DNA结合的风险,倘若不能以空载为对照,会有假阳性结果;另外,在抗体选择时,尽量选择较小分子量的标签,如Flag、HA、His等,不推荐使用大分子量的标签蛋白,可能会由于空间阻位干扰正常的DNA和蛋白结合。

Q4:转录因子类的抗体还有特别要注意的地方吗?

A4:转录因子ChIP-seq较组蛋白难做的原因除了其表达丰度较低之外,许多的转录因子的表达往往是诱导型表达的,是瞬时表达的,不像组蛋白那么稳定,因此,在样本的准备阶段就要严格检测。除此之外,关于抗体准备阶段有个小细节也应该受到关注,即不同转录因子的剪切体的存在。有些转录因子在生物体内通常会有不同的剪切体,不同剪切体的表达量也会有差异,而抗体制备过程中抗原的位点设计,不同品牌抗体会有所差异,选择合适的抗体就变得非常重要了。通过将研究的转录因子的序列与抗原位点进行比对即可知道该抗体是否满足研究需求。

Q5: 免疫沉淀中如何进行微珠的选择?

A5:磁珠较琼脂糖微珠有着较强的优势:更方便快捷的洗涤条件;避免使用封闭的DNA,更适合ChIP-seq;更好的富集度和更低的本底信号。在Protein A、 Protein G、 Protein A/G的选择上,不同的珠子有各种的优点:Protein A与兔多抗体结合能力强;Protein G:结合范围较广;Protein A/G:背景较低;建议在磁珠选择上选择Protein A/G磁珠。

Q6: 如何确定ChIP实验是否成功?

A6:通过实时荧光定量PCR对富集后的产物进行分析是在ChIP-seq之前检测ChIP实验是否成功的一种较为有效的方法。首先,确认感兴趣蛋白质-DNA相互作用的靶位点基因序列。对于转录因子的引物:分析启动子区域“motif”富集区域(MEME分析工具),在TTS附近100bp-2kb区域内设计多条引物,特别是在100-500bp处;对于阳性引物:任何可能结合的DNA序列;对于阴性引物:凡是不能和蛋白发生互作的DNA(内含子序列,管家基因等)。通过与阴性抗体lgG及阳性和阴性引物的数据的比较,从免疫沉淀效率(Input率)和DNA蛋白结合能力(富集倍率)两个方面并结合文献已知数据来衡量实验是否成功。

Q7: ChIP-DNA建库前的质控都有什么?

A7:DNA的质量、浓度及片段大小在建库之前都是需要进行考量的,浓度较低或片段过大,对建库和测序均存在有风险。对于浓度较低的,通常建议进行多次IP后把产物合并。对于片段较大的有些小伙伴们会问,那能不能再将这些大片段进行打断来满足建库呢?NO,NO,NO,这是坚决不允许的!因为二次打断会增加假阳性率。因此,这就是之前为什么强调合适片段化的重要性。

    文库顺利建成,终于可以长舒口气了。看了ChIP-seq路上可能遇到的这些坑,是不是就感觉ChIP-seq想做好真的很不容易了。对了,我们的线上课堂本周三会给大家线上分享躲坑秘籍,届时欢迎大家互相分享经验噢!


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关键词:ChIP-seq,抗体,免疫共沉淀

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